Нови биокомпоненти и биогенни наночастици от хемолимфата на морски охлюв Rapana venosa срещу рак на кожата
Начало и край на работния пакет: от Месец 1 до Месец 12
Ръководител на работния пакет: доц. д-р Александър Долашки
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет: Колектива на ИОХЦФ-БАН
Планирани дейности:
Дейност 1.1. Изолиране на 3 фракции и хемоцианин (RvH) от хемолимфата на R. venosa.
Дейност 1.2. Биохимичен анализ на изходния екстракт от ХRv и получените три фракции: определяне на общ белтък, скриниг за захари (тест орцинол/H2SO4), определяне на вторични метаболити с МТ под 3кДа чрез масспектрометрия; определяне на елементния състав на хемолимфата чрез ICP-MS; електрофоретични изследвания: нативна и денатурираща ПАГЕ - идентифициране на протеините в 3-те фракции чрез ImageQuant™ TL v8.2 софтуер.
Дейност 1.3. Определяне на антиоксидантните свойства на получените три фракции от ХRv: общ антиоксидантен капацитет, анти-оксидантната активност чрез DPPH анализ, оценка на общия неензимен антиоксидантен капацитет, антиоксидантни ензими (СОД, каталаза и глутатион) и пероксидазна активност.
Начало и край на работния пакет: от Месец 4 до Месец 6
Ръководител на работния пакет: проф. дн Павлина Долашка
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет: Колектива на ИОХЦФ-БАН
Планирани дейности:
Дейност 2.1. Зелен синтез на БНЧ-ци от Фракция 1 и метални соли (прекурсори на Ag+, Cu2+, и Zn2+ йони) при различни условия (концентрация на компонентите, температура и рН на средата).
Дейност 2.2 Получаване на БНЧ-ци от Фракция 2 и метални соли (прекурсори на Ag+, Cu2+, и Zn2+ йони) при различни условия (концентрации на компонентите, температура и рН на средата).
Дейност 2.3 Получаване на БНЧ-ци от Фракция 3 от хемолимфата на R. venosa и прекурсори на Ag+, Cu2+, и Zn2+ йони при различни условия (концентрации на компонентите, температура и рН на средата).
Дейност 2.4 Доказване на получените БНЧ-ци, медиирани от биомолекулите в ХRv чрез сравнителен анализ на трите фракции преди и след зеления синтез на БНЧ-ци чрез: UV-Vis спектроскопия; FTIR спектроскопия; RP-HPLC анализи; Електрофоретичен анализ на фракциите с констатирани различия в хроматограмите.
Начало и край на работния пакет: от Месец 10 до Месец 21
Ръководител на работния пакет: проф. д-р Ива Угринова
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет: Колектива на ИМБ-БАН
Планирани дейности:
Дейност 3.1. Изследване на цитотоксичния ефект на получените фракции от ХRv (Ф1 с МТ < 30 кДа; Ф 2 с МТ 30-100 кДа; Ф 3 с МТ> 50кДа, след отстраняване на нативния RvH), нативния RvH и неговите две изоформи (RvH1 и RvH2): върху ракови клетъчни линии от меланом (A375, KRAS A375 и Hs 895.T), кожен карцином (А431) и нормални кожни клетъчни линии (HaCaT и Hs 895.Sk). определяне на селективен антитуморен ефект.
Дейност 3.2. Изследване на цитотоксичния ефект на новите БНЧ-ци: върху ракови клетъчни линии от меланом (A375, KRAS A375 и Hs 895.T), кожен карцином (А431) и нормални кожни клетъчни линии (HaCaT и Hs 895.Sk). определяне на селективен антитуморен ефект.
Дейност 3.3. Микроскопско наблюдение, анализ на морфологичните промени и тестване на клетъчната жизнеспособност с Trypan Blue след третиране с най-активната фракция от хемолимфата и БНЧ-ци с най-обещаващи антитуморни резултати.
Дейност 3.4 Изследване ефекта на най-активната фракция от ХRv и БНЧ-ци с най-висок антипролиферативен ефект върху образуването на колонии в клетъчни линии на рак на кожата.
.Дейност 3.5. Идентифициране на компоненти в най-активната фракция от хемолимфата на R. venosa и структурна характеристика на био-наночастиците с най-висок антитуморен ефект
Начало и край на работния пакет: от Месец 13 до Месец 24
Ръководител на работния пакет: доц. д-р Людмила Велкова
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет: Колектива на ИОХЦФ-БАН
Планирани дейности:
Дейност 4.1. Идентифициране на активните компоненти във фракцията от ХRv с най-висок антитуморен потенциал чрез: пречистване на FPLC или RP-HPC система; анализ на 1Д- или 2Д-ПАГЕ, чрез MS- и MS/MS- експерименти и биоинформатика.
Дейност 4.2. Структурно характеризиране на синтезираните биогенни НЧ-ци от хемолимфата на черноморски охлюв R. venosa, с най-висок антитуморен потенциал чрез: UV-Vis спектроскопия; сканираща електронна микроскопия, комбинирана с енергийно-дисперсионна спектроскопия (SEM/EDS); FT-IR и Раман спектроскопията и Раман микроскопията; рентгенова дифракционна (XRD) спектроскопия, определяне на зета потенциал.
Дейност 4.3. Сравнителен анализ на характеристиките на получените Ag-, Cu- и Zn-НБЧ-ци от фракция най-висок антитуморен потенциал от ХRv и характеристиките на БНЧ-ци докладвани в научната литература, като обещаващи антитуморни агенти при рак на кожата.
Начало и край на работния пакет: от Месец 19 до Месец 30
Ръководител на работния пакет: доц. д-р Людмила Велкова и проф. д-р Ива Угринова
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет: Колективите на ИОХЦФ-БАН и на ИМБ-БАН
Планирани дейности:
Дейност 5.1. Изследване на типа клетъчна смърт предизвикана от най-активната фракция от ХRv посредством флуоресцентен микроскопски анализ и с FACS анализ и с оцветяване с Annexin/PI.
Дейност 5.2. Изследване на антипролиферативния ефект на най-активните БНЧ-ци чрез имунофлуоресцентен анализ с EdU/?H2AX маркиране.
Дейност 5.3. Установяване на връзка между оксидативния стрес и антитуморната активност на най-активната фракция от ХRv и БНЧ-ци с най-висок антитуморен потенциал върху меланомна ракова клетъчна линия чрез микроскопски наблюдения на живи клетки, оцветени с багрило TMRE.
Дейност 5.4. Количествена оценка на реактивните кислородни видове в живи меланомни ракови клетки преди и след третиране с най-активната фракция от ХRv и БНЧ с най-висок антитуморен ефект.
Дейност 5.5. Имунофлуоресцентен микроскопски анализ и Western Blot анализ на ключови протеини, участващи в процесите на програмирана клетъчна смърт и автофагия (p53, NF-k?, LC3).
Дейност 5.6. Протеомени изследвания на механизма на антитуморната активност на най-активната фракция от ХRv и най-активните БНЧ-ци върху кожна ракова клетъчна линия въз основа на 2Д-гел електрофорези, масспектрометрични изследвания и биоинформатика.
Начало и край на работния пакет: от Месец 1 до Месец 36
Ръководител на работния пакет: доц. д-р Людмила Велкова
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет: Колективите на ИОХЦФ-БАН и ИМБ-БАН
Планирани дейности:
Дейност 6.1. Научно техническото координиране и управление.
Дейност 6.2. Административно и финансово управление.
Дейност 6.3. Управление на информацията и комуникация.